Los fitoplasmas patógenos vegetales difíciles de cultivar, un reto para su identificación y control

Tema: Las enfermedades en plantas impactan la producción de alimentos y generan pérdidas económicas. Las plantas enfermas con el patógeno bacteriano conocido como fitoplasma presentan síntomas particulares como la filodia en las flores en algunos cultivos. La investigación sobre fitoplasmas tiene una larga historia, acompañado de grandes retos al tratarse de un patógeno que es complicado de cultivar en medio axénico. 

1. Introducción

1.1 Las plantas también se enferman

La enfermedad puede definirse como un desequilibrio del funcionamiento normal de los procesos fisiológicos, causados por agentes bióticos (infecciosos) y abióticos (no infecciosos: nutricionales, ambientales, etc.). En el caso de enfermedades de las plantas, el agente causal o patógeno (organismo vivo), puede ser un hongo, un virus, una bacteria, un nematodo o una planta parásita. Un agente infeccioso es capaz de reproducirse dentro o sobre su huésped y propagarse. 

Existen tres factores importantes que contribuyen al desarrollo de enfermedad: 1) el huésped susceptible, 2) el patógeno virulento y 3) ambiente favorable (Fig. 1). A esto se le conoce como triángulo de la enfermedad; la enfermedad aparece cuando los tres factores ocurren simultáneamente (Agrios, 2001).

Figura 1. Triángulo de la enfermedad (tomado de Agrios, 2001).

La identificación del patógeno y el diagnóstico temprano de las enfermedades vegetales son vitales para la formulación e implementación de medidas rápidas de control. Esto minimiza la propagación de las enfermedades y reduce las pérdidas económicas causadas por ellas.

2. ¿De dónde surgen las bacterias patógenas de las plantas?

La evolución de las plantas ha ido acompañada de la evolución de microbios beneficiosos y patógenos, esto es reflejado en las continuas asociaciones actuales, que van desde el parasitismo hasta el mutualismo (Delaux y Schornack, 2021). Las bacterias se encuentran entre los microorganismos que colonizan a las plantas como parte de su microbiota (comunidad de microorganismos que habitan un organismo). Las bacterias son organismos procariotas unicelulares de un tamaño de 1-2 µm. Su material genético (ADN), no está encerrado por una membrana nuclear. Las bacterias se reproducen mediante el proceso asexual conocido como "fisión binaria" o "fisión" (una célula se divide en dos). Se transmiten a una planta por medio del agua, insectos, animales (roedores) y por medio del hombre. Las bacterias pueden entrar a la planta a través de aberturas naturales: estomas, lenticelas y también por heridas en hojas, tallos o raíces, o ser introducidas por ciertos insectos fitófagos (que se alimentan de material vegetal) (Perilla-Henao y Casteel, 2016).

Cuando la microbiota de una planta está en equilibrio (homeostasis) hay un rango normal de abundancia y composición de las comunidades de microorganismos que la componen, entonces se dice que está en eubiosis (plantas sanas). Por el contrario, si la eubiosis se altera, ya sea por estrés abiótico o infecciones, la homeostasis puede cambiar en la mayoría de los casos hacia un estado disbiótico asociado con impacto negativo en la salud de las plantas (Paasch y Yang, 2021).

La evolución del patógeno vegetal incluye factores como, la interacción con múltiples especies de plantas, otros organismos y el medio ambiente. En la agricultura se emplean: 1) monocultivos con una carga genética desfavorable (un costo de la selección durante la domesticación); 2) se tienen áreas extensas de una sola variedad de cultivo (una pérdida de diversidad); 3) se introducen cultivos en áreas fuera de su origen. Estos factores, favorecidos por la agricultura, ejercen una fuerte selección artificial entre los microorganismos que interaccionan con la planta, al restringir su rango de plantas huésped y adaptarse a un solo cultivo (Malmstrom et al., 2022). Por ejemplo, se sabe que el ancestro de la bacteria patógena P. syringae pv. antirrinos (Pan) no era un patógeno de la planta boca de dragón, pero completó el salto al poder emplear dicha planta como huésped gracias a una evolución aún desconocida obteniendo patogenicidad (Monteil et al., 2013).

2.1 Enfermedades de las plantas causadas por bacterias

Una de las revistas  especializada en estudios moleculares sobre microorganismos patógenos en las plantas, “Molecular Plant Pathology”, convoco a los especialistas a realizar un listado de las bacterias patógenas científica y económicamente más importantes. Así surgió el listado y un artículo científico de revisión nombrado “Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology/Las 10 principales bacterias patógenas en patología molecular de plantas” publicado en el año 2012 (Mansfield et al., 2012). 

La lista incluye nombres como: (1) Pseudomonas syringae (enferma tomate); (2) Ralstonia solanacearum (enferma tomate, tabaco, berenjena y algunas plantas ornamentales); (3) Agrobacterium tumefaciens (empleada como herramienta para la transformación genética de plantas); (4) Xanthomonas oryzae pv. orizae (enferma arroz); (5) Xanthomonas campestris patovares (varios cultivos de importancia agronómica); (6) Xanthomonas axonopodis pathovares (varios cultivos de importancia agronómica); (7) Erwinia amylovora (manzana, pera, membrillo, mora, frambuesa y muchas plantas ornamentales como la rosáceas silvestres y cultivadas; (8) Xylella fastidiosa (vid, cítricos y almendros); (9) Dickeya (dadantii, solani, violetas y papas); y (10) Pectobacterium carotovorum (y Pectobacterium atrosepticum) (papa). Debido a lo limitado de esta revisión del “Top 10” quedaron fuera muchos patógenos importantes como Clavibacter michiganensis (michiganensis y sepedonicus), Pseudomonas savastanoi y Candidatus Liberibacter (pv. asiaticus), o también otros que por ser diferentes no han sido bien estudiados como es el caso de fitoplasma.

2.2 Bacterias diferentes

2.2.1 Clase Mollicutes: micoplasmas y fitoplasmas 

Durante mucho tiempo un grupo de enfermedades muy dañinas en varias plantas con los síntomas como amarillamiento o clorosis foliar, reducción y arrugación de hojas, pérdida del color normal de los pétalos, etc. y transmisión a través de insectos (chicharritas), eran consideradas enfermedades de origen viral. Sin embargo, Doi et al. (1967) a través de microscopia electrónica de transmisión (“Transmission electron microscopy”, TEM)  de tejido de tubos cribosos provenientes de plantas enfermas con dichos síntomas descubrieron bacterias pleomórficas y sin pared  celular,  llamando a estas entidades "organismos semejantes a micoplasmas" (“Micoplasma like organisms”, MLO) debido a su parecido con los micoplasmas humanos y animales por su ultraestructura y morfología (Bertaccini y Duduk, 2009). Después del logro de los japoneses (Doi et al., 1967) los investigadores detectaron fitoplasmas en diferentes plantas con los síntomas de amarillamiento a través de métodos de microscopía electrónica de transmisión y barrido (Fig. 2). 

Figura 2. Imagen elaborada por microscopía electrónica de barrido de tejido de Capsicum annuum (Chile). Flechas negras indican almidón (AL) o fitoplasma (F) (Lebsky y Poghosyan, 2014).

El siguiente paso consistía en aislar esta bacteria para su estudio. Sin embargo, los esfuerzos de cultivarlos en medios artificiales durante años no rindieron buenos resultados (McCoy, 1989; Lee et al., 2000). Aún en nuestros días existe consenso sobre la dificultad y casi imposibilidad de su aislamiento (Wein y Zhao, 2022; Wang et al., 2024). La dificultad reside en que los MLO como patógenos intracelulares obligados, se reproducen sólo en tejidos del floema con alto contenido de azúcares y con presión osmótica adecuada, por eso para su aislamiento y cultivo necesitan condiciones específicas que cubran sus demandas nutricionales.

No obstante, varios grupos de investigación se dedicaron a trabajar en el aislamiento de esta bacteria. En 1972 un grupo de científicos en el Instituto de Microbiologia y Virología en Kiev, Ucrania, lograron elaborar un medio (SMIMB-72 o Scripal Malinovskaya Instituto Micribiologia y Virologia, en ruso) y una técnica especial para aislamiento y cultivo de MLO (Skripal y Malinvskaya, 1984  a y b). En este medio se obtuvieron más de 100 aislados de diferentes plantas con los síntomas de amarillamientono en Ucrania y varias repúblicas de ex la Unión Sovietica (Fig. 3 a y b) (Poghosyan y Lebsky, 2004). Se logró mostrar su diferencia con bacterias, aplicando métodos morfológicos, bioquímicos y serológicos, así como su resistencia a varios grupos de antibióticos. Las publicaciones de Skripal et al. (1984) se encuentran en idioma ruso complicando ser atendidas adecuadamente en su tiempo en “IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Group”. 

Figura 3. Fitoplasmas visualizados con microscopio. a) Células de Mollicutes en cultivo liquido de CMIMB-72 visualizados por microscopía electrónica de transmisión. Se observan dos tipos de células: 1a espiroplasmas, 2a fitoplasmas (flechas azules), b) Colonias de fitoplasmas en la caja Petri cultivadas en medio solido CMIMB-72 y visualizadas con microscopia óptica en cortes finos. Flecha azul, células bacterianas en proceso de fusión binaria (Poghosyan y Lebsky, 2004).

Son contados los éxitos de cultivar fitoplasma, por lo que por años su detección y caracterización ha dependido de las observaciones de microscopia. Sin embargo, se sabe que un organismo, aunque en apariencia parezca ser una especie (fenotipo) a nivel del genoma puede ser otra completamente diferente (Wei y Zhao, 2022); la dificultad de cultivar estos organismos utilizó la taxonomía para su identificación.

3. Taxonomía de fitoplasmas.

La taxonomía se define más comúnmente en biología como la rama de la ciencia, que nombra y clasifica organismos basándose en propiedades compartidas. La taxonomía puede basarse en cualquier combinación de propiedades. Los biólogos ahora están de acuerdo en que la taxonomía debe basarse en las relaciones evolutivas como la forma natural de organizar los organismos. Debido a que las propiedades fenotípicas, la mayoría de las veces, no revelan su ascendencia común, los taxones se organizan en un marco filogenético; en el caso de las bacterias, el gen 16S rRNA que se encuentra en el ADN es el código de barras que permite identificarlas (Hugenholtz et al., 2021).

La primera secuencia de nucleótidos del gen 16S del ARNr de un MLO fue reportado en 1989, teniendo una secuencia de firma única de este gen (>1200 bp). Este hallazgo permitió a los investigadores deducir con estudios conocidos como filogenéticos que la secuencia del gen 16S del ARNr de un MLO era distinta de los micoplasmas. Esto quiere decir que, aunque los MLO y los micoplasmas poseen una apariencia similar bajo el microscopio, a nivel del gen 16S del. ARNr no son iguales (Lim y Sears, 1989; Wei y Zhao, 2022). Esto permitió establecer el nuevo estatus de MLO entre otros procariontes, al denominarlos “phytoplasma” y finalmente, designar un nuevo taxón, “Candidatus (Ca) Phytoplasma”, que los distingue claramente como un grupo monofilético dentro de la clase Mollicutes (Lim y Sears, 1989; Wei y Zhao, 2022).

En 1994 según la propuesta del Comité Internacional de Sistemática (10th Congress of the International Organization for Mycoplasmology), se utilizó el nombre “Fitoplasma” para reemplazar a MLO (Mollicute), conocido en el ámbito taxonómico como: 1) Reino: Bacteria; 2) Phylum: Mycoplasmatota; 3) Clase: Mollicutes; 4) Orden: Acholeplasmatales; Familia: Acholeplasmataceae Género: 'Candidatus Phytoplasma' (Firrao et al. 2004).

Hasta ahora, los fitoplasmas están incluidos en al menos dieciséis grupos ribosómicos (16S ARNr) diferentes que infectan cultivos de hortalizas. Por ejemplo, el grupo de fitoplasmas amarillamiento del aster (16SrI) es actualmente el predominante, seguido por la escoba de bruja del maní (16SrII) (Kumari et al., 2019; Wei y Zhao, 2022; Kirdat et al., 2023).

3.1 Descubriendo el genoma de los fitoplasmas.

La información sobre la secuencia del genoma de los fitoplasmas es esencial para seguir avanzando en su taxonomía. Dado que aún no se ha logrado el cultivo de fitoplasmas axénico, las muestras de ADN para la secuenciación de su genoma, generalmente se preparan a partir de plantas infectadas. Como el ADN de la planta es el componente mayoritario en las preparaciones de ADN genómico de los fitoplasmas, existe el riesgo de contaminación con el ADN de la planta en el proceso de ensamblaje y mapeo del genoma. El primer genoma completamente secuenciado fue del Candidatus Phytoplasma asteris publicado en 2004 por un grupo japonés; desde entonces, y a través de diversas tecnologías de secuenciación y ensamblajes comparativos de genomas, se han logrado obtener 27 genomas completos (Wang et al. ,2024).

Ahora se sabe que los fitoplasmas liberan proteínas dentro de la planta que infectan, para debilitar su sistema inmune y promover su acumulación. Sin embargo, otras proteínas de los fitoplasmas atraen insectos que se alimentan de las plantas infectadas (actuando como vectores o transportadores de la enfermedad) para así poder aumentar la capacidad de reproducción del insecto, contribuyendo a la transmisión de los fitoplasmas. Finalmente, otras proteínas de los fitoplasmas provocan cambios en la forma de las plantas (Oshima et al., 2004; Varghese et al., 2015; Wang et al., 2024). A pesar de los avances aún se tiene mucho por descubrir de estos microorganismos.

4. Los fitoplasmas pueden estar en tu jardín. 

Basados en los síntomas, el insecto vector del patógeno y la identificación a nivel taxonómico empleando el 16S rRNA, se sabe que los fitoplasmas han dañado más de 1,000 especies de plantas. Cuatro de los cultivos alimentarios mas importantes: trigo, arroz, maíz y soja, son susceptibles a las infecciones de fitoplasmas. Entre las verduras afectadas por estos agentes patógenos se incluyen: el tomate, el pimiento, la batata, la patata, la zanahoria y la lechuga. Frutas como la fresa, la uva, la manzana, la pera, el albaricoque, la ciruela, el azufaifo, el olivo y el coco son otras plantas afectadas. La lista incluye árboles maderables, plantas ornamentales e incluso maleza (Wang et al., 2024). 

Dado que los fitoplasmas están ampliamente distribuidos, los podemos encontrar en las flores del jardín, en la palma de coco de una playa, entre otras muchísimas plantas. Así que recuerda, cuando observes síntomas anormales en tu planta como: filodia en flores (coloración verde) o pétalos con apariencia de hojas (Fig. 4a), o palmas con hojas reducidas y amarillas, con la inflorescencia emergente decolorada (Fig. 4b), es posible que estas frente a una planta que está infectada con fitoplasma.

Figura 4. Síntomas debido a una infección por fitoplasma. a) Síntoma de filodia en flores (Bertaccini y Duduk, 2009); b) Síntomas de en hojas y en inflorescencia de palmas (Vázquez-Euán et al. 2011).

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