La caja de herramientas moleculares: CRISPR Cas9

Tema: La ciencia nos presenta diferentes herramientas biotecnológicas que permiten modificar nuestro entorno, en este contexto se presenta la técnica de CRISPR Cas9 como una herramienta de edición genética con la cual podemos modificar, editar, manipular, aumentar la producción y hacer cultivos resistentes a factores bióticos o abióticos.

Introducción

Las bacterias son organismos unicelulares, procariotas, poseen un cromosoma circular y se reproducen por bipartición. El estudio de las bacterias ha fascinado al ser humano debido a sus diversas interacciones. Desde las bacterias asociadas a las plantas hasta aquellas beneficiosas para animales y humanos, así como las temibles bacterias causantes de enfermedades como el ántrax y la lepra. Además, las bacterias son fuente de numerosos metabolitos utilizados en alimentos, medicina e industria. En el campo de la biología molecular, las bacterias son esenciales para el desarrollo de herramientas como las polimerasas, ligasas y enzimas de restricción. Estas últimas, también conocidas como “tijeras moleculares”, se utilizan ampliamente en los laboratorios de biología molecular para cortar el ADN en sitios específicos con alta precisión.  La edición genética utiliza sistemas moleculares complejos para realizar mutaciones o modificaciones en el genoma de un organismo. Anteriormente, se empleaban meganucleasas, como las nucleasas dedos de zinc (ZFN) y nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALENs), para modificar el ADN. Sin embargo, debido a su complejidad, estas tecnologías tuvieron aplicaciones limitadas y solo se conocen unos pocos casos exitosos. Con la llegada del sistema CRISPR-Cas9, todos los esfuerzos se han centrado en esta nueva herramienta de edición genética. Desde la aparición del sistema CRISPR/Cas9, los sistemas de edición genética previos han quedado en segundo plano. En la actualidad, CRISPR/Cas9 se considera una caja de herramientas moleculares con múltiples capacidades. No solo corta el ADN de manera precisa, sino que también puede dirigir ese corte a un sitio específico dentro del genoma. Además, se puede programar para realizar diversas modificaciones, como inserciones, deleciones, inversiones, ediciones, marcajes y correcciones. Parece no haber límites para las posibilidades que ofrece, y se vislumbra como una biotecnología revolucionaria de gran alcance (Figura 1).

Figura 1. La caja de herramientas moleculares. Imagen generada con IA: https://designer.microsoft.com/image-creator

Historia de CRISPR / Cas9.

El primer reporte de las secuencias CRISPR las realizó un grupo de científicos japoneses liderados por Nakata en 1989, quienes publicaron un estudio donde se menciona la aparición de secuencias de ADN repetidas y atípicas en Escherichia coli, sin embargo, en ese momento se desconocía cuál era su función. En 1993 el investigador español Francis Mojica de la Universidad de Alicante en España, reportó una serie de regiones repetidas interespaciadas, que se encontraban en bacterias del grupo de las Arqueas que crecían en aguas salobres. Más tarde se descubrió que el sistema CRISPR-Cas9 protege a las bacterias contra los virus, es decir es un sistema inmunológico de las bacterias para defenderse de los virus. La bacteria al ser infectada por un virus atrapa un fragmento específico de ADN y lo guarda entre las secuencias repetidas de esta manera queda la memoria para que, en un futuro, cuando el virus vuelve a atacar a la bacteria, tenga un fragmento de ADN para identificarlo y mediante las nucleasas cortarlos y no dejar que la vuelva a infectar cortando el ADN viral, inactivando al virus (Figura 2).  Por eso les llamaron "Repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente espaciadas"   y su acrónimo es "CRISPR" por sus siglas en inglés. Los descubrimientos de este sistema fueron tan importantes para el desarrollo de la ciencia que Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna, recibieron el premio nobel de química en el año 2020 por el desarrollo de la tecnología del sistema CRISPR aplicado a hongos, animales y plantas.

Figura 2. Fases del sistema CRISPR Cas9. Tomado de https://innovativegenomics.org/es/crisprpedia/crispr-en-la-naturaleza/.

¿Qué es la tecnología CRISPR / Cas9?

CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición del genoma dirigida por ARN y proteínas que permite a los investigadores realizar silenciamiento génico, inserciones y deleciones en cualquier línea celular que permita la inserción de un plásmido. El sistema de edición del genoma CRISPR/Cas9 consta de dos componentes: la endonucleasa Cas9 y un ARN guía (sgRNA). El ARN guía dirige a Cas9 a una ubicación específica en la secuencia del genoma donde se llevará a cabo la edición. El sitio PAM (Motivo Adyacente del Protoespaciador) ubicado dentro del ARN guía (secuencia NGG) reconoce el sitio de ruptura de la cadena y Cas9 desenrolla la doble cadena de ADN, escindiendo ambas cadenas al reconocer una secuencia diana indicada por el ARN guía (Figura 3).

Figura 3. Componentes del sistema CRISPR Cas9. Figura creada con https://app.biorender.com/

¿Qué aplicaciones puede tener la tecnología CRISPR/Cas 9?

Mediante el uso de una proteína de fusión de Cas9, es posible manipular con precisión prácticamente cualquier secuencia genómica específica a través de un breve tramo de ARN guía. Esta tecnología ha permitido realizar avances muy significativos en la genómica de plantas. Se ha reportado que plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con el sistema CRISPR fueron decapitadas e injertadas con plantas que no tenían el sistema CRISPR. Después de un tiempo, se analizaron los injertos y se descubrió que presentaban mutaciones realizadas en las hojas por el sistema CRISPR. La realización de este experimento abre la posibilidad de producir plantas que reflejen la edición genética mediante CRISPR/Cas9, sin que los genes involucrados estén presentes en la parte aérea de la planta. Esto significa que el fruto resultante estaría libre de genes exógenos, lo que podría ser beneficioso para la seguridad alimentaria y la producción agrícola. Otro avance reciente fue la comercialización de un tomate editado con CRISPR con niveles elevados de GABA en septiembre de 2022 en el mercado japonés. En el año 2015, Yang y otros investigadores estadounidenses observaron en el cultivo de champiñones que, al cortarlos o manipularlos, podían ponerse de color pardo debido a la acción de las enzimas llamadas polifenoloxidasas. Con la ayuda de CRISPR/Cas9, se logró modificar los genes de las enzimas polifenol oxidasas (PPO), responsables de la oxidación. Al eliminar algunas bases en el genoma del hongo, se suprimió la actividad de uno de los seis genes de las enzimas polifenol oxidasas, reduciendo la actividad en un 30% (Figura 4). Esta aplicación podría repetirse en el aguacate, por ejemplo, para evitar que el guacamole se oxide y pierda su característico color verde olivo, haciéndolo más atractivo para el consumidor. Otro caso exitoso es el de la caña de azúcar. La caña de azúcar es una planta poliploide, lo que significa que tiene varias copias de sus cromosomas. Utilizando la tecnología CRISPR, los científicos editaron diferentes copias del gen LG1 (40 copias en todo el genoma), lo que permitió modificar el ángulo de las hojas de la caña de azúcar. Esta modificación permite a la planta capturar mayor cantidad de luz, aumentando así su productividad. Algunas plantas de interés agroalimentario en las cuales se ha realizado la edición genética se enlistan en el cuadro 1.

creada con https://app.biorender.com/

Cuadro 1. Plantas de interés agrícola que se han editado genéticamente con la tecnología CRISPR.  Modificado de Verma et al, 2023.

Perspectivas de la tecnología CRISPR/Cas9

Podemos comparar la tecnología CRISPR/Cas9 con una herramienta multifuncional, y lo más importante, programable y dirigible. Imagina que tenemos en nuestras manos una caja de herramientas moleculares capaz de generar cambios a nivel genómico en cualquier organismo. Esta caja incluye sensores de movimiento, un termómetro, una tijera, una navaja, un sacacorchos, una aguja, un destornillador, una lija, un GPS, y más. Las aplicaciones de esta tecnología aún son incipientes; aunque conocemos solo una pequeña parte de los sistemas CRISPR en bacterias, sabemos que tienen diversas aplicaciones que son prácticamente ilimitadas. Podemos inferir que CRISPR/Cas9 será una tecnología revolucionaria que cambiará no solo la forma de hacer investigación, sino también nuestra percepción de la vida desde múltiples ángulos. Debido a las diversas áreas que promete esta tecnología, su impacto será profundo. La edición genómica dirigida basada en nucleasas específicas de sitios ha evolucionado como un método más sofisticado, preciso y confiable para la manipulación de genomas.

Figura  4. Hongo champiñón. A. Champiñón mostrando el pardeamiento causado por la acción de las enzimas polifenoloxidasas. B. Champiñones sin pardeamiento. Fotos tomadas de: https://chilebio.cl/2016/04/15/modifican-hongo-con-nueva-tecnica-biotecnologica-para-ser-resistente-a-la-oxidacion/

Conclusiones 

Sin embargo, ¿por qué todavía no se pueden trasladar todos estos avances de la ciencia a áreas como la salud, la agricultura y los alimentos? Existen varias razones para este retraso, incluyendo limitaciones técnicas, legales y éticas. Dentro de las limitaciones técnicas, en muchos organismos no se ha secuenciado todo el genoma. Como nuestra herramienta CRISPR/Cas9 puede realizar inserciones o deleciones en secuencias específicas mediante el reconocimiento de bases, podría haber regiones idénticas dentro del genoma. Esto podría llevar a que la modificación ocurra tanto en el gen de interés como en otras regiones del genoma, lo cual podría ser indeseable. A pesar de estas limitaciones, el uso de CRISPR/Cas9 en la agricultura ha traído consigo múltiples avances. Por ejemplo, ha mejorado el rendimiento, la calidad y la resistencia a plagas y enfermedades en las plantas. También ha aumentado el valor nutricional, mejorado el color, la textura y el aroma/sabor de los alimentos. Además, se han explorado aplicaciones industriales como biocombustibles, fibras y caucho, así como productos farmacéuticos. La adaptación de las plantas al cambio climático también es un logro importante. Además, existen preocupaciones éticas, legales y de seguridad. En términos legales, muchos países aún no tienen legislación específica sobre la edición genética. Un caso es en la Unión Europea, donde se está debatiendo si considerar los alimentos obtenidos de plantas editadas genéticamente como alimentos transgénicos. A pesar de estos desafíos, las investigaciones actuales prometen un avance considerable en biotecnología y agricultura. La principal desventaja del sistema CRISPR/Cas9 se centra en la posibilidad de generar mutaciones fuera del sitio deseado (mutaciones indeseables). Sin embargo, esta tecnología se perfila como más efectiva, económica y escalable que las técnicas anteriores. Además, no es la única herramienta para editar el genoma; recientemente se ha descrito una proteína derivada de un gen saltarín que permitirá editar grandes regiones del genoma, abriendo así un nuevo campo en la edición genómica.

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